Il secondo piano del Museo è dedicato alla pittura fra il Cinquecento e il Settecento. Protagoniste dell'allestimento del magnifico salone sono quindici Pale di grandi dimensioni, che rappresentano un nucleo rilevante della collezione del museo. Provengono in prevalenza dalle chiese della città e sono confluite nel patrimonio del Comune per lo più nell'Ottocento, in seguito alle soppressioni ecclesiastiche.

"Eseguite fra il tardo Cinquecento e il primo Settecento - spiega l'assessore alla cultura Anna Beltrame - parlano di una città centro propulsivo di idee e artisti, in un territorio fitto di conventi, di chiese, oratori e tabernacoli: l'allestimento del salone crea un effetto davvero suggestivo". Alla seconda metà del Cinquecento appartengono ad esempio lo Sposalizio mistico di Giovan Battista Naldini e il pontormesco Tobiolo e l'Angelo, una delle invenzioni pittoriche più felici del Poppi. All'inizio dei Seicento risalgono le tre superbe pale, una di Santi di Tito e due di Alessandro Allori, dipinte per la cappella degli Spini a Peretola e donate al Museo da Angela Riblet nel 2011. Dalla chiesa di San Francesco provengono altre due pale del XVII secolo: la raffinata Annunciazione di Giovanni Bilivert e il suggestivo Miracolo di San Nicola da Tolentino di Mario Balassi. Il Settecento è rappresentato da un altro Miracolo di San Nicola da Tolentino, dipinto da Sigismondo Betti e l'Annunciazione di Giovan Domenico Ferretti - provenienti dalla perduta chiesa del monastero di San Matteo -, e dalla pala dedicata a Santa Caterina d'Alessandria di Francesco Conti, già nella Basilica di Santa Maria delle Carceri. Le altre tre sale del secondo piano sono dedicate a opere di minore formato, ma non di minore valore, tra il '500 e il '600. Un primo nucleo di dipinti, realizzati a esempio da Giovan Maria Butteri, Giovan Battista Naldini e Ridolfo del Ghirlandaio, esprime la ricchezza della cultura figurativa toscana nel Cinquecento, da una parte legata al gusto di corte, dall'altra espressione di un'arte più devota, aderente ai dettami del Concilio di Trento. Il secondo nucleo testimonia la profonda influenza di Caravaggio nella pittura del Seicento, a cominciare dallo splendido Noli me tangere di Battistello Caracciolo, ma anche nei dipinti di Cecco Bravo, Mattia Preti e Nicola Malinconico.